La malaria sigue siendo una preocupación crítica para la salud global, especialmente en regiones tropicales y subtropicales, donde causa una considerable morbilidad y mortalidad. Los métodos de diagnóstico actuales, como la microscopía y los ensayos basados en PCR, son confiables, pero a menudo imprácticos en entornos con recursos limitados debido a su dependencia de equipos complejos y personal capacitado. Este estudio ha desarrollado una plataforma de diagnóstico de malaria innovadora al combinar el método de extracción de ADN Chelex-100/hervido con un ensayo de Amplificación Isotérmica Mediado por Bucle-MicroScanner (LAMP-MS). El método Chelex-100/hervido es más simple y rentable que los procesos convencionales de extracción de ADN, lo que lo hace adecuado para su uso en entornos con recursos limitados.
Características del Ensayo LAMP-MS
El ensayo LAMP-MS permite la detección multiplex a través de un diseño de microchip con cuatro cámaras. Cada cámara del microchip está precargada con cebadores específicos que apuntan a Pan, Plasmodium falciparum (Pf), Plasmodium vivax (Pv) y un control interno, minimizando la amplificación no específica en las reacciones LAMP multiplex. En una evaluación clínica de 260 muestras, el ensayo demostró una sensibilidad del 97.5% para el objetivo Pan y del 100% para el objetivo específico de Pf en 80 muestras clínicas de Plasmodium falciparum. De manera similar, para las 80 muestras clínicas de Plasmodium vivax, el ensayo logró una sensibilidad del 95% para el objetivo Pan y del 94% para el objetivo específico de Pv. Notablemente, en las 100 muestras clínicas no infectadas, el ensayo exhibió una especificidad del 100%, sin observarse falsos positivos. Estos hallazgos sugieren que el LAMP-MS es una alternativa rápida y confiable a los métodos basados en PCR, especialmente en entornos con recursos limitados.
Importancia de un Diagnóstico Temprano
La malaria es una enfermedad febril transmitida por la picadura de mosquitos Anopheles infectados que portan protozoos del género Plasmodium, predominantemente encontrados en regiones tropicales. Entre los cinco tipos de malaria que pueden infectar a los humanos, P. falciparum y P. vivax son los más comunes. P. falciparum se encuentra principalmente en África, mientras que P. vivax es más frecuente en el sudeste asiático y el Pacífico occidental. La malaria representa un problema de salud pública global significativo, con aproximadamente 241 millones de casos reportados en 2020, lo que resultó en alrededor de 627,000 muertes, la mayoría de las cuales fueron niños menores de cinco años en África subsahariana. La carga de la malaria sigue ejerciendo una presión significativa sobre los sistemas de salud, las economías y las comunidades, particularmente en regiones con acceso limitado a la atención médica.
Un diagnóstico temprano y preciso de la malaria es crucial para un tratamiento efectivo y para reducir la carga de la enfermedad, especialmente en entornos con recursos limitados. La malaria es una enfermedad que requiere atención inmediata, ya que un diagnóstico tardío puede resultar en complicaciones severas o la muerte. Los métodos tradicionales de diagnóstico de malaria incluyen microscopía, pruebas rápidas de diagnóstico (RDT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cada uno de estos métodos de diagnóstico tiene sus propios beneficios y limitaciones, lo que hace necesario adaptar las estrategias de diagnóstico según los recursos disponibles y las necesidades locales específicas.
Limitaciones de los Métodos de Diagnóstico Tradicionales
La microscopía es un método bien establecido y ampliamente disponible que requiere equipos de laboratorio básicos, reactivos y suministros. Se preparan y tiñen frotis de sangre con Giemsa para identificar parásitos de malaria. Esta técnica proporciona información valiosa para las decisiones de tratamiento. Sin embargo, la microscopía es laboriosa y requiere un microscopista capacitado, y su precisión puede verse limitada por la calidad de la tinción y la habilidad del técnico. Las pruebas rápidas de diagnóstico (RDT) han ganado popularidad como un medio alternativo para establecer un diagnóstico rápidamente. Estas pruebas detectan antígenos específicos de malaria en la sangre de un paciente utilizando métodos inmunocromatográficos. Las RDT son particularmente útiles en áreas remotas donde la microscopía no es factible debido a la falta de personal capacitado o infraestructura de laboratorio. El uso de RDT permite un tiempo de respuesta rápido, a menudo dentro de 15-20 minutos, lo que las hace ideales para pruebas en el punto de atención. Sin embargo, la sensibilidad de las RDT puede verse comprometida en casos de baja parasitemia.
La PCR es una herramienta de diagnóstico molecular que ofrece alta sensibilidad y especificidad para detectar ADN de Plasmodium. Esta técnica es capaz de diferenciar entre especies de malaria e incluso identificar infecciones mixtas, lo que la convierte en una herramienta invaluable para la investigación y la confirmación de casos. Sin embargo, la PCR requiere equipos especializados y personal capacitado, lo que limita su aplicabilidad en entornos remotos o con pocos recursos. La principal limitación de la PCR en situaciones agudas es que requiere un tiempo de procesamiento más largo y una infraestructura de laboratorio sofisticada, que a menudo no está disponible en las áreas más afectadas por la malaria.
Nuevas Técnicas Emergentes para el Diagnóstico de Malaria
Dadas las limitaciones de los métodos de diagnóstico tradicionales, se han desarrollado varias técnicas emergentes para mejorar la velocidad, precisión y accesibilidad de los diagnósticos de malaria. La Amplificación Isotérmica Mediada por Bucle (LAMP) ha surgido como una alternativa prometedora para el diagnóstico de malaria, particularmente en áreas con infraestructura de salud limitada. LAMP es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos isotérmica que permite amplificar ADN o ARN a una temperatura constante, eliminando la necesidad de equipos de ciclado térmico utilizados en la PCR. Esta simplificación hace que LAMP sea más adecuado para su uso en el campo, ya que requiere solo una infraestructura de laboratorio mínima. LAMP proporciona resultados en menos de una hora y ha demostrado tener alta sensibilidad y especificidad, comparable a la PCR.
La tecnología basada en LAMP es adecuada para diagnósticos en el punto de atención, y se han desarrollado varios métodos de detección en los últimos años. La LAMP colorimétrica permite una confirmación visual fácil de la amplificación de ADN al detectar cambios de pH, lo que resulta en un cambio de color, eliminando la necesidad de equipos especializados. Esto la hace altamente ventajosa en entornos con recursos limitados. Además, los productos amplificados por LAMP pueden ser detectados utilizando tiras de flujo lateral (LFD), lo que permite una visualización rápida de los resultados, convirtiéndola en una solución práctica para entornos con infraestructura de laboratorio limitada. La LAMP en tiempo real, que utiliza un dispositivo portátil de amplificación isotérmica y colorantes fluorescentes para monitorear el proceso de amplificación en tiempo real, es particularmente útil para la investigación diagnóstica.
Desarrollo de un Método de Diagnóstico LAMP-MS
Recientemente, se desarrolló un nuevo método de diagnóstico basado en LAMP que permite la detección visual de pirofosfato de magnesio, un subproducto de la amplificación LAMP, utilizando un microscopio o un microscanner. Basado en esta tecnología, en este estudio se desarrolló una plataforma de diagnóstico de malaria al combinar el método de extracción Chelex-100 con el ensayo LAMP-MS. Específicamente, se optimizó el método de extracción de ácidos nucleicos Chelex-100/hervido para muestras de sangre de malaria y se diseñó un microchip para detectar malaria, que incluye objetivos Pan, Pf, Pv y controles internos (IC). El rendimiento de la plataforma se evaluó comparando su sensibilidad, especificidad, límite de detección y aplicabilidad en el campo con los de un kit comercial de qPCR.
Para determinar las condiciones óptimas para la extracción de ADN de muestras de sangre utilizando el método Chelex-100/hervido, se realizaron experimentos combinando diferentes concentraciones de sangre total (2.5%, 5%, 10%) en una solución de resina Chelex-100 al 10% y diferentes concentraciones de resina Chelex-100 (5%, 10%, 20%) en un tampón Tris-EDTA con sangre total al 2.5%. Los resultados experimentales se compararon y analizaron utilizando los ensayos de Malaria Pan qPCR y Malaria Pan LAMP. En los experimentos con diferentes concentraciones de sangre, se extrajo y analizó ADN de una solución de Chelex-100 al 10% mezclada con sangre total en concentraciones de 2.5%, 5% y 10%. Los resultados de Malaria Pan qPCR mostraron valores Ct de 19.23, 19.57 y 19.80, con valores RFU de 3163, 1767 y 865, respectivamente. Los resultados de Malaria Pan LAMP mostraron tiempos de amplificación de ácidos nucleicos de 12.94 min, 13.06 min y 13.55 min, con valores RFU de 3020, 2010 y 1209, respectivamente. En ambos ensayos, la muestra de sangre al 2.5% demostró los valores Ct más rápidos y los valores RFU más altos. Por lo tanto, se determinó que una concentración de sangre del 2.5% era la óptima para la extracción de ADN. A continuación, se realizaron experimentos con diferentes concentraciones de resina Chelex-100 (5%, 10%, 20%) en un tampón Tris-EDTA con sangre total al 2.5% para la extracción de ADN. En el ensayo Malaria Pan qPCR, los valores Ct fueron 24.94, 22.23 y 21.99, con valores RFU de 6390, 6645 y 5846, respectivamente. En el ensayo Malaria Pan LAMP, los tiempos de amplificación de ácidos nucleicos fueron 13.13 min, 12.08 min y 12.12 min, con valores RFU de 4918, 4654 y 4146, respectivamente. Mientras que los resultados de qPCR indicaron el valor Ct más rápido con la solución Chelex-100 al 20%, los resultados del ensayo LAMP se utilizaron para determinar las condiciones óptimas. Basado en el ensayo LAMP, la solución de resina Chelex-100 al 10% mostró el valor Ct más rápido y el valor RFU más alto, lo que la convierte en la concentración óptima de solución de resina Chelex-100. En conclusión, se identificaron las condiciones óptimas para la extracción de ADN como una concentración de sangre del 2.5% y una concentración de solución de resina Chelex-100 del 10%.
Evaluación del Rendimiento Clínico del Ensayo LAMP-MS
El rendimiento clínico del ensayo Malaria Pan/Pf/Pv/IC LAMP-MS se evaluó utilizando 260 muestras clínicas, que comprendían 80 muestras de Plasmodium falciparum (Pf), 80 muestras de Plasmodium vivax (Pv) y 100 muestras clínicas no infectadas. Todos los ADN fueron extraídos de muestras clínicas utilizando el método de extracción de ADN Chelex-100/hervido. Los resultados se analizaron en comparación con el kit comercial RealStar® Malaria Screen & Type PCR. Para las muestras de P. falciparum, el ensayo LAMP-MS demostró una sensibilidad del 97.5% para el objetivo Pan (IC del 95%: 91.3–99.7) y del 100% para el objetivo específico de Pf (IC del 95%: 95.5–100.0), mostrando un rendimiento equivalente al del kit RealStar® PCR. Ambos ensayos exhibieron una especificidad del 100% para la detección de P. falciparum, sin observarse falsos positivos para ningún objetivo. Para las muestras de P. vivax, el ensayo LAMP-MS registró una sensibilidad del 95% para el objetivo Pan (IC del 95%: 87.7–98.2) y del 94% para el objetivo específico de Pv (IC del 95%: 86.0–97.9). En contraste, el kit RealStar® PCR demostró una sensibilidad del 100% para el objetivo específico de Pv, indicando una ligera diferencia en el rendimiento. Sin embargo, ambos ensayos lograron una especificidad del 100% para la detección de P. vivax, sin observarse falsos positivos en todos los objetivos. Finalmente, para las 100 muestras no infectadas, el ensayo LAMP-MS exhibió una especificidad del 100% en todos los objetivos diagnósticos (Pan, Pf y Pv), mientras que logró una sensibilidad del 100% para el control interno (IC). Estos resultados fueron consistentes con el kit RealStar® PCR. Estos hallazgos destacan el rendimiento comparable del ensayo Malaria Pan/Pf/Pv/IC LAMP-MS en comparación con el kit RealStar® PCR en la detección de P. falciparum. Aunque el ensayo LAMP-MS mostró una sensibilidad ligeramente inferior para P. vivax, su capacidad para proporcionar resultados precisos con alta especificidad subraya su fiabilidad como herramienta de diagnóstico para la malaria.
Especificidad y Reactividad Cruzada del Ensayo LAMP-MS
La reactividad cruzada del ensayo Malaria Pan/Pf/Pv/IC LAMP-MS se evaluó utilizando muestras infectadas con otros virus. El ensayo se probó contra el virus Zika, el virus Chikungunya, el virus de la encefalitis japonesa y los virus del dengue (tipos 1, 2, 3 y 4). Los resultados mostraron que el ensayo Malaria Pan/Pf/Pv/IC LAMP-MS no exhibió reactividad cruzada con ninguno de estos virus, con resultados negativos para todos los objetivos (Pan, Pf, Pv y el control interno [IC]). Además, cuando se probó con ADN de sangre humana total y agua destilada, el ensayo mostró resultados positivos solo para el control interno (IC), mientras que los objetivos Pan, P. falciparum y P. vivax retornaron resultados negativos. Estos hallazgos indican que el ensayo Malaria Pan/Pf/Pv/IC LAMP-MS tiene una excelente especificidad y no presenta reactividad cruzada con otros virus, lo que lo convierte en una herramienta altamente confiable para el diagnóstico de malaria.
Conclusiones y Futuras Direcciones
La malaria es una enfermedad que plantea serios problemas de salud en todo el mundo, infectando a cientos de millones de personas y causando cientos de miles de muertes cada año. Esta enfermedad es prevalente principalmente en regiones tropicales y subtropicales, convirtiéndose en un obstáculo significativo para el desarrollo económico y la salud pública. En este contexto, un diagnóstico rápido y preciso en el punto de atención de la malaria es esencial para el tratamiento temprano de los pacientes y la prevención de la propagación de la enfermedad. Sin embargo, los métodos de diagnóstico convencionales de malaria, especialmente los diagnósticos moleculares basados en PCR, ofrecen alta sensibilidad y especificidad, pero tienen limitaciones en entornos con recursos limitados debido a la necesidad de equipos complejos y personal capacitado.
Para superar estas limitaciones, se desarrolló una plataforma de diagnóstico de malaria al combinar el ensayo LAMP-MS con el método de extracción Chelex-100/hervido. En particular, el método de extracción Chelex-100/hervido es más simple y rentable en comparación con los procesos tradicionales de extracción de ácidos nucleicos, lo que lo hace aplicable incluso en entornos con recursos limitados. Además, el ensayo LAMP-MS utiliza la formación de pirofosfato de magnesio durante la reacción LAMP como un marcador visual, permitiendo la observación directa de la amplificación de ácidos nucleicos a través de un microscopio o un microscanner. Este enfoque simplifica el proceso de detección, reduce costos y mejora la accesibilidad del ensayo para pruebas en el punto de atención.
Una de las principales limitaciones de este ensayo es el riesgo de contaminación cruzada durante la carga de muestras en los canales del microchip, particularmente en entornos de campo donde las condiciones de laboratorio controladas pueden no estar disponibles. Dado que la pipeteo es un paso esencial en este método, se debe considerar el potencial de contaminación por aerosol y el arrastre entre muestras. Además, el requisito de múltiples pasos de pipeteo aumenta la probabilidad de error humano, lo que puede afectar la reproducibilidad y fiabilidad del ensayo. La investigación futura debería centrarse en el desarrollo de un sistema de cartucho completamente cerrado, que minimizaría la pipeteo manual y mejoraría aún más la aplicabilidad en el campo al reducir los riesgos de contaminación y mejorar la usabilidad.
En conclusión, la combinación del método de extracción Chelex-100 y la plataforma multiplex LAMP-MS ofrece un enfoque altamente prometedor para el diagnóstico de malaria en términos de velocidad y precisión. Sin embargo, aunque la plataforma demuestra resultados alentadores, se necesita una validación adicional para confirmar su viabilidad en condiciones reales de campo. Específicamente, se deben evaluar estudios adicionales sobre el rendimiento del ensayo cuando se realiza completamente en entornos de campo, incluyendo consideraciones para la pipeteo, procesos de múltiples pasos y control de contaminación. Además, su aplicabilidad a muestras de sangre seca y muestras de sangre capilar debe ser evaluada para garantizar su usabilidad práctica en áreas remotas o con recursos limitados. Aunque puede haber algunas limitaciones de sensibilidad en comparación con la PCR, el ensayo es particularmente útil en entornos con recursos limitados y puede contribuir significativamente a la gestión efectiva y erradicación de la malaria. Mejoras futuras en la sensibilidad para P. vivax y la inclusión de especies adicionales de malaria podrían ampliar aún más las capacidades diagnósticas del ensayo.
Los autores agradecen a la Agencia de Control y Prevención de Enfermedades de Corea (KDCA) por proporcionar muestras de virus Zika, Chikungunya y encefalitis japonesa. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de Desarrollo de Tecnología de Salud de Corea, a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea. La investigación fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Hospital Universitario de Corea.
Fuente: https://www.nature.com/articles/s41598-025-92935-4